藁本内酯抗人肺癌A549细胞增殖作用研究

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　　摘要：目的 探讨藁本内酯抗人肺癌A549细胞增殖的作用机制。方法 CCK-8法检测藁本内酯对A549细胞活力的影响，TUNEL法检测细胞凋亡率，Hoechst 33258荧光染色法观察A549细胞的形态变化，ELISA检测血管内皮生长因子(VEGF)含量，Western blot检测核因子-κB(NF-κB)、Bcl-2、Bax及磷酸化JNK蛋白表达。结果 15、30、60、120、180 μmol/L藁本内酯作用12、24、48 h能抑制A549细胞活力(P<0.05，P<0.01， P<0.001)，并呈剂量及时间依赖(P<0.05，P<0.01);30、60、120 μmol/L藁本内酯作用12、24、48 h，细胞凋亡率呈时间和剂量依赖(P<0.05，P<0.01);经藁本内酯处理48 h后，A549细胞核可见明显凋亡形态，包括核皱缩、碎裂、亮蓝色荧光，染色质分割产生凋亡小体;30、60、120 μmol/L藁本内酯细胞核内NF-κB蛋白p65亚基表达升高、细胞内JNK蛋白磷酸化水平升高、抑凋亡蛋白Bcl-2表达降低及促凋亡蛋白Bax表达升高(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。结论 藁本内酯通过抑制VEGF的表达而抑制肿瘤新生血管的形成，通过调控NF-κB蛋白表达及JNK蛋白磷酸化水平，降低Bcl-2/Bax比值，诱导肿瘤细胞凋亡。

　　关键词：藁本内酯;A549细胞;凋亡;血管内皮生长因子;核因子-κB

　　藁本内酯是当归、川芎等中药中主要活性成分之一，对心脑血管、循环系统及免疫功能均有较强的药理作用[1-2]。研究表明，藁本内酯具有抗肿瘤活性，能够诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖、转移及肿瘤的生长、浸润[3-5]。本研究以肺腺癌A549细胞为模型，观察藁本内酯诱导A549细胞凋亡的影响，并探讨其作用机制，以期为临床藁本内酯治疗肺癌提供实验数据。

　　1 材料与方法

　　1.1 药物与细胞

　　藁本内酯，天津士兰科技有限公司，纯度>98%;A549细胞购自ATCC。

　　1.2 主要试剂与仪器

　　CCK-8试剂盒，上海博谷生物科技有限公司;蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、TUNEL试剂盒及人血管内皮生长因子(VEGF)ELISA试剂盒，Roche公司;Hoechst 33258试剂盒，上海依科赛生物制品有限公司;细胞核和胞质蛋白提取试剂盒，生工生物工程上海(股份)有限公司;DMSO及胎牛血清(FBS)，Gibco公司;兔抗人核因子-κB(NF-κB)、磷酸化-JNK(P-JNK)、Bcl-2及Bax抗体，Santa Cruz公司。荧光显微镜IX51(日本Olympus公司)，ELx800酶标仪(美国BioTek公司)，Z-323高速低温离心机(德国HERMLE公司)，FCM流式细胞仪(美国BD)。

　　1.3 细胞培养

　　A549细胞在含10%胎牛血清和青霉素100 μg/L、链霉素100 μg/L的DMEM培养基中，37 ℃、5%CO2孵育。细胞贴壁生长，2～3 d传代1次。细胞生长至对数期时开始实验，待细胞生长至80%时，serum- starved 10 h后用于实验。

　　1.4 CCK-8法检测细胞活力

　　取对数生长期细胞，37 ℃预热，PBS洗3次， 0.25%胰酶消化，制成细胞悬液，以100 μL/孔(6000 cells)接种在在96孔板中，37 ℃、5%CO2培养箱中预培养，待细胞生长至80%时，serum-starved 10 h。给予含藁本内酯15、30、60、120、180 μmol/L的无血清培养基，继续培养12、24、48 h，溶剂对照给予稀释倍数与最大药物浓度相同的DMSO(下同)。除去含药/溶剂培养基，并用新鲜培养基洗涤细胞2次，加入新的培养基，每孔加入10 μL CCK-8溶液。将培养板在培养箱内孵育4 h后用酶标仪测定450 nm处的吸光度(OD值)。

　　1.5 TUNEL法检测细胞凋亡率

　　取对数生长期细胞，以2 mL/孔(3×105 cells)接种在6孔板中，37 ℃、5%CO2培养箱中预培养，待细胞生长至80%时，serum-starved 10 h。实验组给予藁本内酯30、60、120 μmol/L，继续培养12、24、48 h。1500 r/min离心5 min，收集细胞，用4%多聚甲醛固定细胞，置水平摇床上缓慢摇动30～60 min，重悬细胞，然后根据TUNEL试剂盒说明书采用流式细胞仪进行检测。

　　1.6 Hoechst 33258荧光染色法检测细胞核形态

　　细胞接种同“1.3”项。6孔板中置大小合适灭菌的载玻片。serum-starved 10 h后，实验组分别给予30、60、120 μmol/L藁本内酯，继续培养48 h。弃去培养液，用4%多聚甲醛在4 ℃条件下固定15 min，弃固定液养液，Hoechst 33258染色液室温条件下染色15 min。镜检。

　　1.7 ELISA检测血管内皮生长因子含量

　　细胞接种同“1.3”项。取对数生长期细胞，以2 mL/孔(3×105 cells)接种在6孔板中，37 ℃、5%CO2培养箱中预培养，待细胞生长至80%时，serum- starved 10 h。实验组给予含藁本内酯30、60、120 μmol/L的无血清培养基，继续培养48 h。取培养液，1000 r/min离心5 min，除去细胞碎片及颗粒物，收集上清。根据VEGF试剂盒说明书进行操作。

　　1.8 Western blot检测核因子-κB、磷酸化JNK、Bcl-2及Bax蛋白表达

　　按“1.3”项步骤收集细胞培养液，冰浴的PBS洗1遍，用细胞刮子刮下细胞，1000 r/min离心5 min，收集细胞沉淀，分别提取总蛋白和细胞核蛋白。在细胞沉淀中加入适量裂解液(含蛋白酶或磷酸酶抑制剂)，冰浴裂解30 min，每隔10 min高速涡旋15 s。4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清，BCA法测定样品中总蛋白浓度;用细胞核蛋白抽提试剂盒，根据说明书提取细胞核蛋白。上样量为40 μg。一抗(兔抗人NF-κB(p65)、P-JNK、Bcl-2、Bax均按1∶1000稀释)4 ℃过夜，二抗(1∶10 000稀释)37 ℃孵育2 h， ECL法显色。采用软件Image pro plus 6.0分析条带的积分光密度。

　　1.9 统计学方法

　　采用SPSS16.0统计软件进行分析。实验数据以─x±s表示，结果中“2.1”“2.2”项采用双因素分析，其余数据进行单因素分析及LSD-t组间检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 藁本内酯对A549细胞活力的影响

　　与溶剂对照组比较，予藁本内酯孵育12、24、48 h后，细胞活力均明显下降(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，说明藁本内酯能够抑制A549细胞的增殖，其IC50分别为121.98、89.99、62.70 μmol/L。藁本内酯对A549细胞的抑制作用呈时间和浓度依赖性(P<0.05，P<0.01)，两者之间无交互作用(P>0.05)。结果见表1。

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